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抗体标记HRP的比例问题

作者：福因德科技（武汉）有限公司 2025-08-06T00:00 (访问量:1784)

我们这款HRP快速标记试剂盒可标记抗体和非抗体蛋白在内的多种生物大分子，前提是其表面存在游离伯氨基（-NH₂）。标记比例由目标分子的分子量及其表面游离伯氨基（-NH₂）的数量决定。

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免疫学实验中常采用伯氨基（-NH₂）进行标记。由于该方法并非定点标记，操作上相对宽泛，其效果在很大程度上依赖于实验人员的技术水平，这需要通过大量的实践经验积累来提升。

从大量抗体标记实践中，我们总结出一个抗体分子通常可标记约4个标记物分子（包括荧光素、Biotin、HRP等酶）。基于此，我们常指导客户采用“等量”标记物。然而，客户常反馈困惑：“等量”具体指等体积、等摩尔量，还是等质量？我们之前的表述存在歧义——准确建议应为“等质量”。

针对“等质量”比例的合理性，我们基于以下两方面：1）基于抗体与HRP分子量及其表面可利用伯氨基（-NH₂）的理论计算；2）关键的实验验证：
验证实验设计： 设置四组平行标记反应，每组使用100 µg抗体，分别加入20 µg、50 µg、100 µg、200 µg活化HRP，严格遵循试剂盒说明书操作。
ELISA检测： 抗原按100 ng/孔包被ELISA板，封闭后，将四组标记产物分别进行倍比梯度稀释，并加入对应孔位反应。洗涤后，加入TMB底物显色，终止后读数。
结论： 数据明确显示，100 µg抗体对应100 µg HRP的标记比例已足够（即可获得理想信号）。继续增加HRP用量不仅无效（浪费），反而可能因过量的HRP而增加非特异性背景。

经实验推算，每个抗体分子平均标记了3.5个HRP分子。对该抗体进行生物素标记并计算效率后，也获得了基本相同的数值（约3.5）。

关于生物素标记及生物素标记效率的计算，我们下次专门讲解一期。

明确了抗体标记的比例后，如何估算普通蛋白标记所需 HRP 的量呢？假设一个分子量为 25 kDa 的目标蛋白，其表面平均可及伯胺基（-NH₂）数量为 2 个，HRP 的分子量为 44 kDa。若按每个伯胺基可偶联一个 HRP 分子计，则标记 1 mg 该目标蛋白所需的理论 HRP 质量可按以下公式计算：

步骤1: 计算1 mg蛋白的摩尔数
蛋白摩尔质量= 25,000 g/mol。
蛋白质量 =1 mg =0.001 9。
0.001g
=4x 10-8mol.蛋白摩尔数 = 质量/摩尔质量 =
25,000g/mol
步骤2: 计算可用的伯氨基总数
每个蛋白分子有2个伯氨基。
总伯氨基摩尔数 = 蛋白摩尔数 x每个蛋白的伯氨基数=4x10-8molx2=8x10-8mol
步骤3: 计算结合的HRP摩尔数
每个伯氨基结合一个HRP分子，因此HRP摩尔数=总伯氨基摩尔数=8x10-8mol.步骤4: 计算结合的HRP质量

。HRP摩尔质量=44,000 g/mol。
。HRP质量=HRP摩尔数xHRP摩尔质量=(8x10-8mol)x(44,000g/mol)
。计算:
8x10-8x44,000=8x10-8x4.4x104=35.2x10-4g=3.52x10-3巴转换为毫克(1g=1000 mg)3.52 x10-3g=3.52mg.

1mg 该蛋白对应活化HRP（可标记HRP)为3.52mg

灵魂拷问：如何确定蛋白表面的可用伯氨基（-NH₂）数量？

此问题涉及因素复杂，难以在此详述。若条件允许，建议参考本文所述的梯度标记实验，筛选最佳标记比例；若无实验条件，则可按每个蛋白分子表面平均含 2-5个可利用伯氨基（-NH₂） 进行初步估算；直接数蛋白序列中赖氨酸的个数，通过这个方法计算蛋白表面的可用伯氨基（-NH₂）数量肯定是不可取。

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